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流式细胞仪知识大盘点

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流式细胞仪知识大盘点
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编辑时间 : 2020-09-22

1.流式细胞仪的概念


流式细胞术(flow cytometry , FCM):


是一种定量分析技术,是指利用流式细胞仪检测细胞特异性标记荧光信号而测定细胞的多种生物物理性质的方法,同时也是一项可以把具有某相同荧光信号特性的某些细胞亚群从多细胞群体中分离和富集出来的细胞分析技术。


流式细胞仪(flow cytometer):


是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术和抗原抗体检测技术为一体的新型高科技仪器。


是以激光为光源、检测生物学颗粒理化性质的仪器。


生物学颗粒包括大的免疫复合物、DNA、 RNA、染色体、蛋白质、脂质体、细胞器、病毒颗粒、细菌、真菌、真核细胞、杂交细胞、聚集细胞等。


理化性质包括细胞大小、细胞形状、细胞膜完整性、胞浆颗粒化程度、DNA含量、总蛋白含量、酶活性等。


2.流式细胞仪的发展历史

1934年,Moldavan使悬浮的红细胞从一个毛细玻璃管中流过,每个通过的细胞可被一个光电装置记录下来。这就是流式细胞仪的雏形。


1965年,Kamentsky用紫外吸收和可见光散射两个参数同时测量未染色细胞,给出细胞中核酸的含量和细胞大小。奠定了多参数流式细胞测量的基础。


1967年,Van Dilla和Los Alamos采用了层流流动室和氩激光器,开发出了液流束、照明光轴、检测系统三者相互垂直的流式细胞仪。这成为目前各种流式细胞仪的基础。


1969年,Fulwyler利用静电墨水喷射液滴偏转技术,建立了流式细胞分选术。

Ehrlich和Wheeless利用飞点扫描技术和缝扫描技术使零分辨率的流式细胞仪变成了低分辨率的流式细胞仪。


20世纪70年代,随着Kohler和Milstein成功提出了单克隆抗体技术和荧光标记技术,为特异研究和分析细胞奠定了良好的基础。


1973年,美国BD公司和美国斯坦福大学合作,研制开发并生产了世界上第一台商用流式细胞仪FACS I。


20世纪80年代,流式细胞仪的数据采集、存储、显示、分析日趋完善,随着样品制备方法的增加,新的荧光染料和细胞标记物的出现,使流式细胞仪的应用范围逐渐扩大。


20世纪90年代,与之配套的标本制备仪和自动进样器的问世,以及适合临床应用的单克隆抗体的增加,使流式细胞仪逐渐从科研单位进入医院的中心实验室和检验科,成为现代化的临床检验仪器的一部分。


目前,流式细胞仪同时朝着更加专业化和更加普及化的两个不同的方向发展。


更加专业化是指仪器更精密、更灵敏地进行更多参数的分析和更快、更纯地进行细胞分选。


更加普及化是指仪器更易于使用,使之成为实验室里更常用的仪器。


3.流式细胞仪的特点

FCM与其他细胞分析技术相比,有如下特点:


高速度:每秒可检测1 000~5 000个细胞。

高灵敏度:每个细胞只要带有1 000~3 000个荧光分子就能检出,两个细胞之间有5%的差别就可区分出来,光散射的灵敏度为0.3um。

高精度:在细胞悬液中测量细胞,比其他分析技术的变异系数更小,分辨率高。

高纯度:分选细胞的纯度可大于99%以上。

多参数:可同时定量检测单个细胞的DNA等多个参数。

在适当的条件,可对活细胞进行无害性分析和分选。


4.流式细胞仪的检测范围


 检测范围:凡细胞内能进行荧光标记的成分或变化都可用流式细胞仪进行检测。


5.流式细胞仪的分类


根据功能不同,可分为临床型和综合型(科研型)。


根据有无细胞分选功能,可分为流式细胞分析分选仪和流式细胞分析仪。


根据结构不同,可分为一般流式细胞仪(零分辨率流式细胞仪)和狭缝扫描流式细胞仪(高分辨率流式细胞仪)。前者的激光光斑为椭圆形,光斑直径大于被检细胞体积。后者激光光束为一条线状扁平光斑,直径在3~5um。



6.流式细胞仪的基本原理



1、将悬浮分散的单细胞悬液,经特异性荧光染料染色      后,放入样品管。


2、在气体压力的作用下,悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室,流动室充满鞘液,在鞘液的约束下,细胞排列成单列由流动室的喷嘴喷出,成为细胞液柱。


3、液柱与水平方向的入射激光束垂直相交,相交点称为测量区。通过测量区的细胞受激光照射后发出荧光,同时产生光散射。这些信号分别被成90℃角方向放置的光电倍增荧光检测器和前向角放置的光电二极管检测器接收,经过转换器转换为电子信号。


4、电子信号经模/数转换输入计算机。计算机通过相应的软件储存、计算、分析,就可以得到细胞的大小和活性、核酸含量等理化指标。


细胞分选原理

在压电晶体上加上频率为30kHz的信号,使之产生同频率的机械振动,流动室也随之振动,这样通过测量区的液柱断裂成一连串均匀的液滴。


在细胞形成液滴以前,各类细胞的特性已在测量区被测定并储存。如果其特性与要分选的细胞相同时,仪器就在这类细胞形成液滴时给该液滴充与指定的电荷,这样,当被选定的细胞形成液滴时就带有特定的电荷,未被选定的细胞形成的细胞液滴及不含细胞的空白液滴不被充电,也就不带电荷。


带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时,依据所带电荷符号向左或向右偏转,落入指定的收集器内,不带电荷的液滴不发生偏转,垂直落入废液槽中排出,从而实现细胞的分类。


荧光染色原理

免疫荧光染色:细胞膜上或细胞内的抗原分子与相应的荧光素标记McAb作用一定时间后形成带有荧光素的抗原抗体复合物,经激光激发后发出特定的荧光,其荧光强度与被测定抗原分子含量呈比例关系,由此可求得被测细胞与标记McAb相对应抗原的表达量和阳性细胞百分比。


常用的荧光染料有异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻青蛋白(APC)和Perdinin叶绿素(PerCP)等,经488nm激光激发后其发射荧光光谱有差别,因而可将其用于标记不同的McAb进行单色或多色免疫荧光染色。目前,流式细胞术有单色、双色、三色、四色、五色荧光分析,对细胞的分析更加精密、深入。


免疫荧光染色常用方法:


直接免疫荧光法:用一种(单色)或者多种(多色)荧光素标记的McAb染色细胞后测量其荧光强度和阳性细胞数。


间接免疫荧光法:用一种McAb与细胞作用后,洗去未结合McAb,再加入荧光素标记的第二抗体(如羊抗鼠IgG-FITC),染色细胞后测量其荧光强度及阳性细胞数。


7.流式细胞仪的基本结构


流式细胞仪基本结构包括五部分:

       (1)光源

       (2)液流系统

       (3)信号接收系统

       (4)信号处理系统

       (5)细胞分选器

    以上整个系统由电子电路和计算机控制,用以收集、显示、分析、储存被测定的各种信号及控制细胞的分选收集。

 











8.流式细胞仪的测试方法

流式细胞仪的测试方法:一般包括5个步骤。


① 制备合格的单细胞悬液。在FCM技术中,制备出合格的单个细胞悬液是最为关键的一个环节。

② 对需测量的细胞生物化学成分进行荧光标记染色。

③ 进行流式细胞仪测量。

④ 对测量资料进行定量分析。

⑤ 对测量分析结果在生物学上的意义予以解释。


9.流式细胞仪的应用

流式细胞技术在细胞生物学中的应用

流式细胞技术在免疫学中的应用

流式细胞技术在肿瘤学中的应用

流式细胞技术在血液学中的应用


10.流式细胞仪选型的关键参数

配置:激光器数目和荧光通道数目;

灵敏度:能检测最小粒子的大小;

              能检测细胞上最少的荧光分子的数量(MESF);

分辨率:衡量仪器测量精度的指标(CV);

分析速度:指每秒分析的粒子个数;


11.流式细胞仪的实验流程




12.流式细胞仪的品牌信息收集



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