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流式细胞仪的基本原理(1):光学原理

流式细胞仪的基本原理(1):光学原理
流式细胞仪的基本原理(1):光学原理
流式细胞仪的基本原理(1):光学原理
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编辑时间 : 2021-01-26

流式细胞仪的基本原理(1):光学原理


  什么是流式细胞仪?


  流式细胞仪是一种自动分析和分选细胞的设备。流式细胞仪主要由四部分组成:流动室和液体流动系统;激光源和光学系统;光电管和检测系统;计算机和分析系统。


  流式细胞仪是一种基于光学的检测器,类似于人眼识别物体的原理,只是它“看到”的物体与人眼能看到的物体大小不同。一般肉眼可以分辨物体的大小,以毫米为单位,可见光的波长范围为770 ~ 350纳米。


  流式细胞仪能看到的物体大小是微米级的细胞或颗粒,波长范围多在可见光范围内。


  细胞本身不发光(弱光,自发荧光),需要用发光物质标记。这种物质就是“荧光”


  关键词:荧光


  又称“荧光”,是指一种光致发光。常温物质受到一定波长的入射光(通常是紫外线或X射线)照射时,吸收光能进入激发态,立即失活,发出波长比入射光长的出射光(通常在可见光波段);并且一旦入射光停止,发光现象立即消失。


  所以要从细胞发光和流式细胞仪光学检测系统两个方面来理解流动的工作原理。


  常见荧光染料的例子(免疫荧光、核酸染色):


  在免疫荧光染色中,荧光分子需要与抗体结合,与荧光素形成抗原抗体复合物,通过抗原抗体反应对细胞进行标记。例如:


  异硫氰酸荧光素(FITC):激发光波长为488nm(在蓝色光谱范围内,也称为“蓝色激光”),最大发射波长峰值约为520nm(绿色);


  藻红蛋白(PE):激发光波长为488nm,最大发射光波长峰值为575nm(橙色);


  别藻蓝蛋白(APC):激发光的波长为635nm(在红色光谱范围内,也称“红色激光”),最大发射光的峰值波长为660nm(红色);


  叶绿素蛋白(PerCP):激发光波长为488nm,最大发射光峰值波长为675nm(红色);


  除上述荧光染料外,还包括各种复合荧光染料,如PerCP-Cy5.5(Ex488nm,Em696nm),PE-Cy5(Ex488nm,Em666nm)等。


  核酸染色是基于荧光染料的理化特性,不需要抗体作为媒介,具有直接结合DNA分子的能力。如碘化丙锭(PI)、赫斯特(HO)等。


  关键词:激发光源


  目前,用于流式传输的激发光源包括弧光灯和激发器。弧光灯多为高压汞灯,激光器根据产生激光的材料种类分为固态激光器、气体激光器、液体激光器和半导体激光器。激发光源的重要特性包括单色性(光源只发射一种波长)和单向性(方向稳定,无测得的像散);衰减(使用寿命)。流式细胞术中激发光源和过滤器的类型或数量决定了一次可以检测到的不同荧光的最大数量(即抗原的数量)。除了蓝色极光和红色激光,常用的激发光源还有紫色激光(激发波长405nm)和黄色激光(561nm)。所谓单光4色,双激光6色或8色,三激光8色或10色等。


  流式细胞仪通过一系列精密光学元件检测各种荧光强度、细胞体积、颗粒等参数,并以各种数据的形式输出给计算机。


  流式细胞仪的光学系统;


  它由几组光学元件组成,如透镜、滤光器和分光镜,它们向不同的探测器发送不同波长的光信号。主要光学元件是滤光片,主要分为四类:长通滤光片(LP)、短通滤光片(SP)、带通滤光片(BP)、分色镜。


  关键词:过滤


  顾名思义,能够过滤一定波长光的光学透镜。长通滤波器允许特定波长以上的光通过,但特定波长以下的光不能通过。例如,LP500滤光器只允许500纳米以上的光通过,而500纳米以下的光被吸收或返回。短通滤波器,与长通滤波器相对。带通滤波器可以允许相当窄范围内的波长通过,它标记了两个值,一个是允许波长的中心值,另一个是允许波长的范围,如BP500/25,表示允许波长范围为475~525nm到525nm,中心值为500nm。二分镜:分为短程二分镜和长程二分镜。长通分色镜(DLP)只允许一定波长以上的光通过,而这个波长以下的光以90反射。短通二元镜(DSP)则相反。


  将血液或骨髓样品与标记有对某些分子有特殊亲和力的荧光素或荧光染料的单克隆抗体结合,制成一定浓度的细胞悬液,放入流式细胞仪的样品管中,细胞在气体压力下进入流动室。流动室充满鞘液。在鞘液的约束下,细胞排成单行,从流动室的喷嘴高速喷出,成为细胞液柱。


  细胞与一种或多种荧光标记的抗体复合物结合,细胞经激光照射后产生荧光。荧光信号通过一组由分色镜和特定波长的带通滤波器组成的光学元件传输到信号采集器(PMT),光学信号被转换成电压脉冲并发送到CPU。每种颜色的荧光占据一个特定波长的探测器,每种颜色的探测器称为荧光通道。


  带有荧光素的抗原抗体复合物经激光激发后在特定波长发出荧光,其荧光强度与被测原始分子的含量成正比,从而可获得抗原的表达量以及被测细胞与标记单克隆抗体对应的阳性细胞百分比。以上数据参考梁志辉等主编的《流式细胞术基本原理及实用技术》和王淑娟等主编的《现代血液学图谱》流式细胞术原理及临床应用,部分数据来自网络


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